----译自Pierce公司的说明

介绍：

NHS及其水溶性同系物Sulfo-NHS常用于将羧基修饰为氨基反应活性的NHS活泼酯。这种方法通常将NHS与含羧基化合物，以及缩合剂如EDC混合后反应而完成的。EDC与羧基反应形成氨基反应活性的中间体，O-酰基脲。该中间体在很不稳定，在水中会很快水解释放出羧基，以及N-酰基化脲。该副反应所产生的N-酰基脲会结合在蛋白疏水区域的缩基上[1,3]。而NHS或Sulfo-NHS介入的反应，可以使形成的中间体在水溶液中保持稳定，从而可以使整个耦联反应分成独立的两步反应。[1,2]

以下方法是在Grabarek和Gergely[1]工作的基础上建立的。该方法可以使两个蛋白成本按照期望的顺序缩和，它通过避免第二个蛋白与EDC接触，从而使该蛋白上的羧基不能发生与氨基的缩合反应。同时由于该方法使用硫醇将第一步反应淬灭，如果第一个化合物会与还原性物质反应，则该缩合方法不适用。

材料：

• 活化缓冲液：0.1 M MES, 0.5 M NaCl, pH 6.0
• 蛋白#1：溶于活化缓冲液中，并配成1mg/ml的浓度。
• 蛋白#2
• NHS或Sulfo-NHS
• EDC
• 2-巯基乙醇
• 凝胶过滤柱(备选)
• 盐酸羟胺

方法：

1. 在1ml蛋白#1的溶液中，加入0.4mg EDC(约2mM)和0.6mg NHS或1.1mg Sulfo-NHS (约5mM)，室温反应15分钟。
2. 加入1.4ul 2-巯基乙醇(终浓度为20mM) 淬灭EDC。
3. 备选：用合适孔径的凝胶过滤柱除去过量的还原剂和未活化的交联剂，并用活化缓冲液平衡。
4. 在反应液中加入与蛋白#1等摩尔数的蛋白#2，室温反应2小时。
5. 反应液中加入盐酸羟胺使终浓度为10mM，用于淬灭任何尚存在于蛋白#1上的未反应的NHS(或Sulfo-NHS)，从而释放出原先的羧基。也可以采用其他的淬灭方法，比如加入20-50mM的Tris、赖氨酸，或乙醇胺。但是这些含伯胺基团的化合物会与蛋白#1上的缩基反应，形成副产物。
6. 用步骤3中的凝胶柱除去过量的淬灭试剂。

通过在NHS活化步骤使用pH5的MES缓冲液，或在两种蛋白交联的一步调节到更高的pH值(pH 7-8.5的磷酸盐或碳酸盐缓冲液)来缩短反应的时间。NHS活化蛋白后形成的活泼酯在pH5时的稳定性比高pH值时更稳定。

参考文献：

1. Grabarek, Z. and Gergely, J. (1990). Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters. Anal. Biochem. 185, 131-135.
2. Staros, J.V., Wright, R.W. and Swingle, D.M. (1986). Enhancement by N-hydroxysulfosuccinimide of water-soluble carbodiimide-mediated coupling reactions. Anal. Biochem. 156, 220-222.
3. Timkovich, R. (1977). Detection of the stable addition of carbodiimide to proteins. Anal. Biochem. 79, 135-143.