作者： 姜雄平　许丹科　刘耀清　马立人

摘　要　用N-乙酰半胱氨酸金表面自组装技术，以及用1-乙基3-（3-二甲氨基）碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)偶联剂把亲合素固定于金表面,再将生物素标记探针固定在亲合素上，来制备核酸传感器探头。然后将探头与目标DNA和第二生物素标记探针进行夹心式杂交，再利用生物素-亲合素的作用联入亲合素标记的碱性磷酸酯酶，用酶催化底物AMPPD发光来达到测定DNA的目的。测定了乙型肝炎病毒（HBV）DNA（566bp）的片段，实验测得HBV-DNA灵敏度为3×10-14 mol/L。
关键词　核酸传感器，化学发光，乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸

Chemiluminesencent Biosensor For Nucleic Acid

Jiang Xiongping*
(Institute for Drug Control of People′s Liberation Army, Beijing　100071）
Xu Danke, Liu Yaoqing, Ma Liren
（Academy of Military Medical Sciences, Beijing　100850）

Abstract　A chemiluminescent biosensor for nucleic acid was described. Gold surface was modified with N-Acetylcysteine to produce a self-assembled monolayer. A single layer film of biotinylated oligonucleotide probes was constructed by binding to a precursor layer of streptavidin which had been immobilized on modified gold surface covalently using carbodiimide hydrochloride(EDC) and N-hydroxysuccinimide(NHS). A sandwich solution hybridization was executed with immobilized deoxyribo-nucleic acid (DNA), target DNA and second biotinylated DNA probes. Then extravidin alkaline phosphatase which can dephosphorylate substrates AMPPD to produce stable intermediates that produce a measurable yield of light output was bound with second hybridized biotinylated DNA probes. And hepatitis B virus (HBV) DNA fragment was measured. The sensitivity of HBV DNA was obtained as 3×10-14 mol/L.
Keywords　Nucleic acid biosensor, chemiluminescence, hepatitis B virus deoxyribonucleic acid

1　引　言
　　新兴的核酸传感器以简单快速和准确的特点在核酸分析领域越来越受到人们的重视。核酸传感器的基本原理为将具有识别核酸特定序列的核酸探针固定于载体上，测定时与待测核酸杂交，并用适当方法将杂交过程显示检测出来
2.2.2　传感器探头的制作　①在饱和湿度下，将10 mmol/L N-乙酰半胱氨酸水溶液5　μL滴于洁净石英金片的金膜表面，室温放置2 h，使其形成单分子层后，用水彻底冲洗，洗去游离N-乙酰半胱氨酸；②趁金表面未干，立即滴加5　μL 100　g/L的EDC溶液和5　μL 100　g/L的NHS溶液（均以10　mmol/L pH　7.4 PBS配制），放置30 min，用PBS pH 7.4冲洗；③立即滴加5 μL 0.2 g/L亲合素溶液（以pH 7.4 PBS配制），4℃饱和湿度下放置过夜后，用PBS pH 7.4冲洗；④滴加5 μL 0.1 mol/L 乙醇胺溶液（用盐酸调pH至8.0）,室温放置1 h（封闭尚未反应的活泼酯基团），用水冲洗干净；⑤滴加5 μL 10 mg/L 探针A（用10 mmol/L pH7.0 PBS配制），放置1 h后用水洗净；⑥滴加 5 μL 1 g/L 生物素溶液（pH7.0 PBS 配制），放置1 h（封闭亲合素中剩余的生物素结合位点，以防止与第二探针的结合），用水洗净，待用。
2.实验方法
2.2.1　石英金片的处理　将石英金片用新制Piranha 溶液（30%H2O2∶H2SO4,1∶3）〔5〕90℃加热1 h，用纯水（Milli-Q）洗净，分别在纯水-乙醇-纯水中超声5 min〔8〕，用纯水洗净待用。
2.2.2　传感器探头的制作　①在饱和湿度下，将10 mmol/L N-乙酰半胱氨酸水溶液5　μL滴于洁净石英金片的金膜表面，室温放置2 h，使其形成单分子层后，用水彻底冲洗，洗去游离N-乙酰半胱氨酸；②趁金表面未干，立即滴加5　μL 100　g/L的EDC溶液和5　μL 100　g/L的NHS溶液（均以10　mmol/L pH　7.4 PBS配制），放置30 min，用PBS pH 7.4冲洗；③立即滴加5 μL 0.2 g/L亲合素溶液（以pH 7.4 PBS配制），4℃饱和湿度下放置过夜后，用PBS pH 7.4冲洗；④滴加5 μL 0.1 mol/L 乙醇胺溶液（用盐酸调pH至8.0）,室温放置1 h（封闭尚未反应的活泼酯基团），用水冲洗干净；⑤滴加5 μL 10 mg/L 探针A（用10 mmol/L pH7.0 PBS配制），放置1 h后用水洗净；⑥滴加 5 μL 1 g/L 生物素溶液（pH7.0 PBS 配制），放置1 h（封闭亲合素中剩余的生物素结合位点，以防止与第二探针的结合），用水洗净，待用。
2.2.3　杂交 ① 短链探针B的杂交：取探针B以杂交液（甲酰胺1.8 mL, 20×SSC 1.0 ml, 50×Denhardts 80 μL, 小牛胸腺DNA 80 μL, 1 mol/L pH 7.4 PBS 80 μL, 20%硫酸葡聚糖钠1.0 mL）〔10〕配制成一定浓度的溶液，将制好的传感器探头与此液30℃杂交1 h，分别用杂交洗液A:2×SSC(含0.1%SDS)，B:0.1×SSC(含0.1%SDS)〔10〕各清洗一次，以除去未杂交的DNA。同时作空白对照。②HBV目标DNA（566bp）的杂交：取HBV目标DNA溶液置沸水浴中加热10 min解链，迅速放入冰水浴中冷却，取一定量加入杂交液，加入探针C使成终浓度10 μg/L, 按，均委托上海生工生物工程公司合成，电泳纯化；目标DNA为乙型肝炎病毒（HBV）DNA片段，用PCR增扩，琼脂糖凝胶电泳分离纯化，含566bp，DNA链两端分别与探针A、探针C互补。微弱光测定仪：BPCL型，中国科学院生物物理研究所；1339型固液相分子杂交仪：北京新技术应用研究所。
3.2.2　底物浓度对测定的影响　分别取pH 9.5的NaHCO3/Na2CO3缓冲液500　μL，加入5　μL 1/5000单位/mL的生物素-碱性磷酸酯酶，和不同量的AMPPD，30℃放置30 min，测定其发光强度，结果表明在加入AMPPD量4～30　mL/L时，发光强度与AMPPD加入量近似于直线关系，加入量大于30 mL/L时发光强度趋于平缓。本实验采用AMPPD终浓度10 mL/L。
3.2.3　酶促反应时间对测定的影响　取pH 9.5的NaHCO3/Na2CO3缓冲液500　μL，加入5　μL 1/5000单位/mL的生物素-碱性磷酸酯酶，5　μL AMPPD，立即作发光强度时间扫描，结果表明反应在20～30 min时达到平衡（参见图1），发光强度趋于恒定，因此测定时采用反应30 min。

图1乙醇胺处理前后的比较
Fig.1 Results of treated and untreated with ethanolamine
1,2,5.(空白)未处理(blank)untreated)3,4,6(空白)已处理(blank)treated。

3. 短链探针B的测定结果
3.3.1　探针B最低检测量　按2.2.3①在杂交液中分别加入不同量的探针B，使成终浓度为100,10,1,0.1 ng/L，结果见表1。测得本法最低可检测1 ng/L(1.6×10-12 mol/L)浓度的探针B。
3.3.2　探针B加入量与光强的关系　测定了探针B加入量（终浓度10 μg/L～3.2　ng/L）与发光强度的关系，结果见图2。表明在浓度2 μg/L以下时发光强度的变化较小。结果显示DNA的加入量与结果并不成线性关系，推测可能由于DNA的浓度很小时，几乎为分子级，杂交数目限制在分子级水平，但当提高DNA浓度时，杂交数目明显增多，故而表现出一定的正比关系，此时可以对DNA作半定量估计。

图2　探针B的加入量与发光强度的关系
Fig.2 Relation between light intensity and added probe B

3.3.3　测定重复性　测定探针B（终浓度100 ng/L）6次，测得光强度为649，582，363，612，451，平均531，RSD为22.6%。表明本法重复性不够理想，不能用于完全定量，只能作半定量估计，这与文献报道一致〔9〕。
3.4　HBV目标DNA（566bp）的测定结果
　　按2.2.3①在杂交液中加入不同量解链后的目标DNA和探针C，使目标DNA的终浓度为500～5　ng/L，结果见表2，表明用本法最低可检测5　ng/L(3×10-14 mol/L)的乙型肝炎DNA片段。

表1　探针B最低检测量测定结果
Table 1　Detection limit for probe B

表2　HBV DNA（566bp）最低检测量测定结果
Table 2　Detection limit for hepatitis B virus (HBV) deoxyribonucleic acid(DNA) fragment

4　结　论
　　N-乙酰半胱氨酸在金表面形成单分子自组装层，用EDC、NHS偶联剂将亲合素固定于金膜，再用亲合素/生物素作为固定生物分子的桥，这种固定生物分子的方法在生物传感器领域越来越受到人们的重视〔1～4，6〕。本实验由于采用了酶促反应和光电倍增管两次放大，因而有较高的灵敏度，对于21bp的短链DNA灵敏度可达1.6×10-12 mol/L，对于HBV目标DNA（566bp）可达3×10-14 mol/L。由于采用了溶液杂交，使测定时间可以在2～3 h内完成。本实验的重复性尚不够理想，还无法实现定量，这还有待于进一步的研究。

References