肽合成
简介
蛋白质存在于一切活细胞中且具有多种生物学活性。具体表现为各种酶、激素、抗生素和受体。肌肉，头发和皮肤的主要部分是由蛋白质构成的。所以，科学家们对于在实验室中合成蛋白质很感兴趣。这种兴趣已发展成一个主要的合成领域称为肽合成技术。
合成肽这一领域的主要目的有4个方面：
1） 证实天然肽的结构即降解技术；
2） 研究蛋白质和肽类的结构与其生物学活性之间的关系以建立他们的分子机制；
3） 合成具有医疗价值的肽如激素和牛痘疫苗；
4） 生产具有免疫原性的新的肽。
固相肽合成(SPPS)
这一技术的基本原理是将α-氨基酸的N端与一端固定在固相支持物上已知序列的一段肽段连接。因为肽段通常是逐步合成的，所以所有的液体试剂可以在每步反应之后用过滤或清洗的方从肽-固相支持物上洗脱下来。当所需的氨基酸合成后，肽段可以从多聚支持物上移下。
固相合成阶段大致过程见图1。固相支持物是含有反应基团如-OH的合成多聚体。这些基团能与N端保护的α-氨基酸的羧基发生反应，然后通过共价键结合到多聚体上。氨基保护基团（X）可以被移走，这样第二个N端保护α-氨基酸可以被在结合至氨基酸链上。这些步骤可重复进行直到获得预期片段。在合成的最后，加入试剂断开氨基酸C-端与多聚支持物的连接；肽段就可以游离于溶液中了。
Fmoc法固相肽合成
多肽链的主要连接是肽键，不同氨基酸的氨基和羧基聚合而成。一般来说，一个氨基酸由一个中心碳原子（称为a-碳原子）及其周围的4个其他基团组成：氢原子，氨基，羧基，以及侧链构象。侧链构象定义为R，表明不同的氨基酸结构。有些侧链含有功能性基团参与肽键的形成。所以，屏蔽氨基酸侧链的功能性基团很重要。
Fmoc合成的大致步骤见图1。首先，第一个Fmoc氨基酸通过一个酸性不稳定连接与不溶性树脂支持物结合。用碱基，通常是哌啶来去除Fmoc的保护性。第二个Fmoc氨基酸使用预先激活的氨基酸或原位活化来结合。目标肽合成后，与树脂结合的多肽去保护，用TFA将其从固相支持物上分离下来。
t-Boc和CBZ肽合成
tBoc合成通用方法见图1。
液相肽合成
逐级浓缩是基于向不断增加的氨基酸组分中反复添加单链N-α保护的氨基酸，一般从链的C'末端氨基酸开始进行合成。可通过采用DCC、混合炭酐或N-羧酐来完成单独的氨基酸的连接。碳酰亚胺法包括用DCC做连接剂连接N-和C-保护氨基酸。重要的是， 这种连接试剂可促进N-保护氨基酸的游离羧基与C-保护氨基酸的游离氨基间的缩水，形成肽链， 同时产出N,N' -dicylcohexylurea副产物。 然而，副反应产生外消旋作用，或在强碱条件下形成5(4H)-唑酮和N-酰基尿素，都会对此方法产生影响。庆幸地是，能将这些副反应最小化，若还不能完全消除，可通过加入一些连接催化剂，如N-羟基琥珀酰亚胺(HoSu)或1-羟基苯并三唑(HOBT)来处理。 此外，该方法也可用于合成N-保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与其它的C-保护氨基酸或肽反应，形成新的肽。
当从副产品二环己基脲中分离活性酯有困难时，可用混合碳酐的方法。该方法由两步组成：（1）用适当的烷基氯碳酸盐，如乙烷基氯碳酸盐或更适宜的异丁基烷基氯碳酸盐，激活N-α保护氨基酸的羧基。激活在有tertiary base存在的有机溶剂中进行；（2）碳酐与氨基酸或肽中的游离氨基反应。碳酐的加量通常为游离氨基的14倍。
虽然此方法在低温时高效高产，且产品纯度高，但也有其缺点， 例如，酐衍生物要经受羰基的强激活作用产生的外消旋作用。然而使用N-α-Urethane保护基团，如Cb2 或tBoc，就可解决此问题。而且，由于它们的高反应性，混合碳酐易形成5(4H)-唑酮、urethanes、diacyimides及酯类，从而比例失调。
高温、延长激活时间（即加入烷基氯碳酸盐和氨基组分至混合酐形成时）、氨基组分所占的空间大小和混合酐的不完全形成，会促进这些副反应的发生。然而大多这些副反应， 除形成哑唑酮和尿烷外，可通过进行低温反应（~ -15℃），和缩短活化时间（~1-2分钟）大为减少。为使哑唑酮和尿烷形成最少化，要实行如下措施：(1) 使用无水有机溶剂，如乙酸乙酯、四氢呋喃、t-丁醇或乙腈；(2)使用tertiary base和N-甲基吗啉；(3) 采用Cbz或tBoc N- α保护氨基酸。
虽然常用异丁基和烷基氯碳酸盐来形成碳酐，但也存在另一些连接试剂。例如：用N-甲氧碳酰基-2-甲氧基-1,2-二氢喹啉（EEDQ）和N-isobutyloxycarbonyl-2-isobutyloxy-1,2-二氢喹啉（IIDQ）与羧基组份反应，形成甲基或、isobutylcarbonate衍生物。 不同于传统的酐形成操作，EEDQ和IIQD无需加碱，也无需低温环境。该操作通常要求某种有机溶剂中的羰基和氨基组分的摩尔量相等，浓度为0.1-0.4M之间。而后加入过量的5-10%的EEDQ或IIDQ，室温下搅拌15-24小时。真空除去溶剂后，残留物溶于乙酸乙酯， 用1N NaHCO3、10%柠檬酸和盐水洗涤，之后用无水Na2So4干燥，蒸发。产品可以重晶结或层析纯化。
这种方法避免了使用碱，但仍有消旋现象和尿烷副产物产生，且程度与传统方法相当。其优势在操作简便。但应注意，迄今为止仍无这两种方法的详细比较。
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